Biodesulfuración de fracciones petrolíferas con "pseudomonas putida" CECT5279: optimización del proceso

Texto en español y resumen en español e inglésLa normativa ambiental europea (Dir. 2003/17/CE 2009) ha obligado a reducir el contenido de azufre en los combustibles fósiles a niveles inferiores a 10 ppm. Actualmente, el uso de métodos fisicoquímicos, como la hidrodesulfuración en serie, permite alcanzar estos niveles, pero a un elevado coste, ya que son necesarias condiciones de trabajo muy severas. El tratamiento biológico de una fracción previamente hidrodesulfurada, reduciría los costes, ya que permitiría trabajar en unas condiciones de operación más suaves. Los procesos de biodesulfuración se basan en el empleo de microorganismos como biocatalizadores para eliminar de forma selectiva el azufre de los compuestos aromáticos que los contienen. En este trabajo se ha utilizado un microorganismo genéticamente modificado, Pseudomonas putida CECT5279, al cual se le han clonado genes procedentes de E.Coli y R..erythropolis IGTS8, confiriéndole resistencia a la tetraciclina y la capacidad desulfurante. Esta bacteria es capaz de metabolizar los compuestos aromáticos azufrados, tales como dibenzotiofeno (DBT) y sus derivados alquilados, dando lugar a la formación del correspondiente compuesto libre de azufre, a través de la ruta 4S, en la se produce una ruptura del enlace C-S sin alterar el anillo aromático del compuesto. En este trabajo se han estudiado en profundidad, una serie de factores que son de gran relevancia de cara a la aplicación industrial del proceso en utilizando células en parada de crecimiento (resting cell) en medio bifásico. En primer lugar, se llevo a cabo el estudio de la producción del microorganismo en biorreactor tipo air-lift, Se optimizaron las condiciones de aireación, obteniéndose las células de máxima capacidad desulfurante al cabo de 12 horas de crecimiento, siendo rendimientos de desulfuración obtenidos aproximadamente el doble que los alcanzados en tanque agitado. Se llevó a cabo la caracterización del consumo y transporte de oxígeno en estas condiciones de trabajo y se relacionó con el desarrollo de la capacidad desulfurante. Por otra parte, debido a la necesidad de utilizar una elevada cantidad de células para el proceso de biodesulfuración en resting cell en tanque agitado, se realizó el cambio de escala de la producción del biocatalizador, utilizando un tanque agitado de 15L. El cambio de escala se ha basado en el mantenimiento del coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, para lo que fue necesario realizar un estudio previo de las condiciones de agitación y aireación en el tanque. Se realizó de forma satisfactoria el cambio de escala, consiguiéndose una elevada cantidad de células sin pérdida de la capacidad desulfurante, en comparación con el protocolo ya existente a escala de tanque agitado de 2L. En una segunda fase del trabajo, se llevó a cabo el estudio cinético de degradación decompuestos modelo como DBT y sus derivados alquilados (4MDBT, 4,6DMDBT y 4,6DEDBT), en distintas condiciones de trabajo: medio acuoso y bifásico, así como en distintas escalas de trabajo: agitador orbital y tanque agitado de 2L, siempre en condiciones de resting cell. Los ensayos se realizaron utilizando los distintos compuestos de manera individual y mezclados. En todos los ensayos, se pudo observar como los compuestos de menor grado de alquilación obtenían mayores velocidades de degradación y mayor rendimiento de conversión, independientemente de la escala y medio de reacción empleado. Por otro lado, se llegó a la conclusión de que las mezclas de compuestos Cx-DBT, dificultaban el proceso de biodesulfuración, reduciendo así su velocidad de degradación y el rendimiento de conversión de estos compuestos. Una vez estudiado el proceso de biodesulfuración para las muestras modelo, se llevó a cabo el estudio cinético de degradación de una muestra real de hidrodesulfurado, cedida por la empresa Repsol-YPF. Previamente, fue necesario identificar y cuantificar los compuestos más abundantes: DBT, 4MDBT y 4,6DMDBT, utilizándose los patrones externos disponibles comercialmente. Se observó que la degradación de estos compuestos seguía la misma tendencia que en el caso de las muestras modelo, de modo que se observaba una mayor degradación para los compuestos de menor grado de degradación, obteniéndose los mayores rendimientos de conversión para DBT, siendo este el compuesto más abundante, y por tanto, eliminándose de forma satisfactoria este tipo de compuestos. En otra fase del trabajo, se abordó el problema de la baja velocidad del proceso de biodesulfuración, en la cual se estudiaron los factores más importantes que limitaban dicho proceso en fase orgánica. En primer lugar se abordaron los problemas de la baja solubilidad de los compuestos Cx-DBT y su transporte desde la fase orgánica hasta la fase acuosa con la adición de surfactantes de distinta naturaleza (Tween 85, Tween 20, SDS, Tritón X-100) y codisolventes (etanol) , así como la optimización de su dosis. El efecto combinado de Tween 85 y etanol como codisolvente, permitieron obtener los mejores resultados de desulfuración. Posteriormente, se estudió el efecto de la adición de una segunda fuente de carbono en el medio de reacción, ya que se pensaba que esta podía ser incorporada al ciclo de Krebs y generar equivalentes reducidos, que posteriormente serían incorporados a la ruta 4S, de modo a reactivar el mecanismo enzimático, mejorándose así los rendimientos de biodesulfuración. Se realizaron distintos ensayos utilizando como sustratos, DBT, DBTO y DBTO2, en condiciones acuosas de resting cell añadiendo como fuentes de carbono, piruvato, citrato y succinato, obteniéndose los mejores resultados en con la adición de 5 g/L de piruvato. Por otro lado, se estudió la reutilización del microorganismo en el proceso de biodesulfuración de DBT, DBTO y DBTO2 en condiciones de resting cell en medio acuoso, sometiendo al microorganismo a tres ciclos de reacción. En dichos ensayos, se mantuvo la concentración de biomasa, la cual era recuperada entre ciclo y ciclo por centrifugación, y siendo resuspendida posteriormente en medio de reacción fresco. En estos ensayos se observó una pérdida de actividad desulfurante al aumentar el número de ciclos, la cual estaría provocada por las continuas etapas de centrifugación, sometiendo al microorganismo a un estrés. La reutilización no puede llevarse en condiciones bifásicas, debido a la elevada toxicidad de la fase orgánica. Finalmente, se realizó la caracterización del consumo y transporte de oxígeno del microorganismo en condiciones de resting cell en medio bifásico del proceso de biodesulfuración de DBT, el cual fue necesario realizarlo en tanque agitado de 2L, debido a que a que en esta escala es posible monitorizar la evolución de oxígeno con el correspondiente sensor. En este ensayo se determinó que los requerimientos de oxígeno necesarios para llevar a cabo los procesos de mantenimiento y biodesulfuración eran muy bajos, por lo que el oxígeno no iba a ser un factor limitante en el proceso de biodesulfuración. En cambio, si se observó una relación entre el suministro de caudal de aire y el rendimiento de biodesulfuración, obteniéndose los mejores rendimientos de desulfuración con un caudal de aire de 1L/L min